Ters Faz Kolonun Yıkanması ve Rejenerasyonu

Welch kolonlarının bakım yöntemlerini biliyor musunuz? 

Bazen HPLC Kolonlarıyanlış yöntemlerle yıkanabiliyor, Bu sebeple  ters fazlı kolonların (ReversePhase) yıkanması(Flushing) ve Rejenerasyonu (Regenaration) yenilenmesi için bazı pratik yöntemler hakkında bilgi vereceğiz.

Ters Faz Kolon

Ters fazlı kromatografi, yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) en yaygın kullanılan tekniktir. Popülerliğinin nedeni, polar olmayan bileşiklerin, zayıf polar bileşiklerin ve iyonik bileşiklerin analizine uygulanabilmesidir. Ters fazlı kromatografide kullanılan sabit fazların çoğu, test edilecek maddeler ile sabit faz arasındaki farklı etkileşimler nedeniyle ayrılan doğal olarak hidrofobik gruplardır.

Ters Faz Kolonlar Nasıl Kirlenir?

En yaygın olarak kullanılan ters fazlı Kolon, silika esaslı Kolondur. Silika matrisinin yüzeyinde çok fazla silanol bulunur. Şekil 1, silanol gruplarının çeşitli olası formlarını göstermektedir. Zayıf asidik bir ortamda, bu silanol grupları, spesifik bileşikler ve matris bileşenleri, özellikle alkalin bileşikler ile etkileşime girerek, alkalin bileşiklerin silika yüzeyinde adsorpsiyonu ile sonuçlanabilir. Aynı zamanda, silika jeldeki geri kalan ağır metal iyonları, silika jel yüzeyine daha fazla asidik madde sokacaktır. Ek olarak, silika jel metal şelatlar veya deterjanlar ile etkileşime girebilir.

Mısır yağı, balmumu ve aromatik bileşikler gibi numune matrisi, ters fazlı ambalaj malzemelerinin (packingmeterials) yüzeyine yapışacak ve özelliklerini değiştirecektir. Protein içeren biyolojik numuneler ayrıca ambalaj malzemesi parçacıklarının yüzeyinde adsorbe edilecektir. Yabancı maddelerin kirletmesini önlemek için numune ön hazırlığı yapılsa bile, test edilecek numunenin matrisi sonunda kolon yüzeyinde adsorbe edilecektir. Kirlenmiş Kolonun kromatografik davranışı kirlenmemiş Kolondan farklı olacaktır.

Genellikle numune matrisi, hedef analitlerle ilgili olmayan kirleticiler içerir; Örneğin, tuzlar, esterler, alifatik bileşikler, organik asitler, hidrofobik proteinler ve diğer biyolojik bileşenler, durağan faz (stationaryphase) ile etkileşime girebilecek maddelerdir. Bu kirleticilerin tutma kapasitesi (retentioncapacity) hedef analitinkinden daha büyük olabilir. Bu beklenmedik kirleticiler detektör tarafından tespit edildiğinde, kromatogram pik çatallanması, taban çizgisi (baseline) dalgalanmaları ve hatta negatif pikler olarak ortaya çıkacaktır.

Kirleticilerin kolon üzerindeki tutma kapasitesi, mobil fazın elüsyon kapasitesi onları yıkamak için yeterli olmayacak kadar güçlü ise, kolon üzerine adsorbe edilen kirleticiler birçok kez enjekte edildikten sonra birikecektir. Kirleticiler birikerek, modifiye edilmiş ambalaj malzemeleri gibi davranacaklardır. Hedef analitler ve bu kontaminantlar arasındaki etkileşim, orijinal ayırma mekanizmalarını etkileyerek, tutma süresinin dalgalanmasına ve pik kuyruklanmasına (peaktailing) yol açacaktır. Daha fazla kirletici madde varsa, basınç çok yüksek seviyeye çıkabilir, hatta maksimum kolon basıncını bile aşabilir.

İleri kullanım ve geri yıkama

Güçlü tutma kabiliyetine sahip kirletici maddelerin çoğu genellikle Kolon başlığında göründüğünden, geri yıkama, kirleticilerin kolondan ayrılmak için ihtiyaç duyduğu mesafeyi büyük ölçüde azaltabilir. Welch’in kolonunun her iki ucunda kullanılan parçaların gözenek boyutu aynı olduğundan, geri yıkama (backflushing)  sırasında ambalaj malzemeleri kolondan atılmaz. Modern paslanmaz çelik kolonların çoğu normalden daha yüksek basınçta paketlenmiştir, bu nedenle Kolon yatağı genellikle geri yıkamadan etkilenmez.

Kolonların yıkama sıklığı, kolona giren güçlü kirletici maddelere bağlıdır. Ters fazlı Kolonlar, çözünürlükte bir azalma belirtisi göstermeden veya anormal maddeleri serbest bırakmadan önce yüksek derecede kirlenmeyi tolere edebileceğinden, kullanıcılar genellikle Kolonun anormal olduğu gözlemlenene kadar Kolonları temizlemez. Ancak kirletici maddelerin birikmesi temizliği daha da zorlaştıracaktır. Bu nedenle, örnek matrisin bir kısmı karmaşıksa, Kolonun düzenli olarak yıkanması önerilir. Kolonu yıkama sıklığı ne kadar yüksek olursa, gereken yıkama prosedürü o kadar basittir.

Kolonun artan basıncı, anormal pik şekli, azalan kolon verimliliği ve çözünürlüğü sorunları olduğunda.

Ters Fazlı Kolonun Kalan Proteinlerini Yıkama

Kirleticiler, kolonda biriken plazma, serum, proteinler ve peptitler gibi biyolojik ise, asetonitril veya metanol gibi saf organik çözücülerin bu kirleticileri çözmesi genellikle zordur. Bununla birlikte, tampon tuzları, asitler veya iyon çiftleri ile karıştırılmış organik çözücüler biyolojik kirleticileri temizleyebilir.

Kolon biyolojik numunelerle kontamine olmuşsa, mobil faz olarak asetonitril: su: trifloroasetik asit (50/50 / 0.1) kullanılmalı ve numune akış hızında 60 kez yıkanması önerilir. Numuneleri enjekte etmeden önce kolonu öncelikle mobil faz ile dengeleyin, daha sonra biyolojik numunelerin ayırma kapasitesi geri yüklenebilir.